淺談基因定位技術(shù)在遺傳病診斷中的應(yīng)用

　
　　[論文關(guān)鍵詞] 熒光PCR定量技術(shù)；基因定位技術(shù)；遺傳病

　　[論文摘要] 熒光PCR定量技術(shù)(Quantitative PCR)是一種新興的基因定位技術(shù)。這項技術(shù)靈敏、簡便、快速、不需使用放射性同位素，PCR完成后，通過測序儀的自動識別即可對待測DNA進(jìn)行定量分析。在遺傳病，特別是一些以大片段缺失為主要突變類型的遺傳病診斷中，熒光PCR定量技術(shù)發(fā)揮了很重要的作用。
　　
　　　　
　　在早期的遺傳學(xué)分子診斷中，主要依賴于Southern Blotting，寡核苷酸雜交等技術(shù)。自1985年Saiki等首次描述聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)以來，PCR技術(shù)因為其靈敏特異，省時省力等諸多優(yōu)點而受到了人們的高度重視，已經(jīng)應(yīng)用于生物和化學(xué)等基礎(chǔ)研究的各個領(lǐng)域，并且成為醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)研究的強(qiáng)有力分析工具之一[1-3]。然而，近幾年來，研究者們不再滿足于得知某一特異DNA序列的存在與否，他們更著眼于對其進(jìn)行精確的核酸定量。盡管把PCR作為一種定量的工具，在技術(shù)上還面臨著一些挑戰(zhàn)。熒光PCR基因定位技術(shù)是近十余年來興起的一種分子生物學(xué)技術(shù)，與其他定量方法相比，具有靈敏、簡便、快速、不需使用放射性同
　　位素的特點，在基因表達(dá)、傳染病和遺傳病的診斷等方面迅速得到了廣泛應(yīng)用。
　　
　　1 熒光PCR基因定位技術(shù)的原理
　　
　　熒光PCR定量技術(shù)的主要原理為：在PCR前，通過化學(xué)方法在引物的5’端通過共價方式連接一個熒光分子。由于在進(jìn)行PCR時，引物和待擴(kuò)增模板5’端的堿基不需要完全匹配，熒光PCR引物和普通PCR引物一樣，能夠?qū)Υ郎y模板進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，根據(jù)PCR的產(chǎn)量，將熒光PCR產(chǎn)物直接或按一定比例稀釋后，和內(nèi)標(biāo)、載樣緩沖液混合，在自動測序儀上進(jìn)行電泳。在自動測序儀內(nèi)激光的激發(fā)下，PCR產(chǎn)物上的熒光分子發(fā)出固定波長的激發(fā)光，被儀器內(nèi)的光電管捕獲。根據(jù)PCR產(chǎn)物從開始電泳到經(jīng)過光電管的時間，測序儀自動計算出相應(yīng)產(chǎn)物的實際堿基數(shù)。不同泳道之間電泳速度的.差別，通過各產(chǎn)物內(nèi)混合的內(nèi)標(biāo)校正。同時，測序儀也自動標(biāo)出相應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，該數(shù)值就是熒光PCR定量技術(shù)對模板進(jìn)行定量與定位的基礎(chǔ)。與非定量PCR分析方法不同，熒光PCR的操作程序有助于評估污染的情況，即測出污染的程度，即使陰性對照產(chǎn)生了正的信號，只要這些信號比實驗樣品的低得多，依據(jù)這樣的結(jié)果，至少可以推測出實驗中所得出的信號是真實的[4-6]。在一定程度上，熒光PCR消除了普通PCR過于敏感、假陽性率高的缺點。熒光PCR常用于研究發(fā)病機(jī)制、估計病毒的負(fù)荷量、監(jiān)測臨床治療進(jìn)展或用于診斷遺傳缺陷等。通過對靶基因量的檢測，將其與疾病的臨床表現(xiàn)、臨床分型以及各種標(biāo)志酶的值聯(lián)系起來，為疾病的診斷和物治療監(jiān)測提供科學(xué)的依據(jù)。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種遺傳病的診斷和產(chǎn)前篩查，如地中海貧血、兒童型脊肌萎縮癥、杜氏/貝氏肌營養(yǎng)不良、胖骨肌萎縮癥和各種染色體病等。
　　
　　2 熒光PCR基因定位技術(shù)在遺傳病診斷中的應(yīng)用
　　
　　2.1 在α地中海貧血中的診斷作用
　　1988年，Chehab用兩對引物同時擴(kuò)增α珠蛋白和β珠蛋白基因，并在這兩對引物上分別標(biāo)記上羅丹明和熒光素。在紫外線的照射下，羅丹明產(chǎn)生紅色熒光而熒光素產(chǎn)生綠色熒光。在同一循環(huán)條件下PCR完成后，通過離心將擴(kuò)增產(chǎn)物和游離引物分離，根據(jù)擴(kuò)增后產(chǎn)物顏色直接判斷基因的缺失情況[7]。如產(chǎn)物為桔紅色，則說明α和β珠蛋白基因都得了擴(kuò)增。如果產(chǎn)物為綠色，說明α珠蛋白基因缺失，只有顯綠色熒光的β珠蛋白基因得到了擴(kuò)增。