1SELEX技術(shù)簡(jiǎn)介

優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)

1)親和力高、特異性強(qiáng)。適配體與靶標(biāo)之間，憑借彼此互補(bǔ)的三維結(jié)構(gòu)，相互作用后形成牢固穩(wěn)定的復(fù)合物，其解離常數(shù)通常能達(dá)到pmol/L～nmol/L的水平，并且能分辨出靶標(biāo)結(jié)構(gòu)上細(xì)微的差別。

2)庫(kù)容量大，識(shí)別范圍廣泛。SELEX技術(shù)的靶標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于經(jīng)典的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，除了有蛋白質(zhì)、核苷酸分子外，還可以是糖類、氨基酸、維生素、抗生素、金屬離子、有機(jī)染料，甚至可以是細(xì)菌、病毒、寄生蟲等完整的細(xì)胞或組織，幾乎囊括了自然界中的全部物質(zhì)。

3)合成容易，獲得方便，易于修飾。適配體的體積比傳統(tǒng)抗體小，篩選過(guò)程簡(jiǎn)便、周期短，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求不高，并具備自動(dòng)化控制的巨大潛力。經(jīng)過(guò)化學(xué)合成和修飾以后可保持原生物活性不變，還可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性并增加其他新的化學(xué)性質(zhì)，參加多類反應(yīng)。標(biāo)記了熒光、生物素和納米金顆粒之后，發(fā)展出了諸如分子成像技術(shù)等疾病診斷新方法。

4)重復(fù)性好，純度高。整個(gè)篩選和制備的過(guò)程在人為控制之下，所得到的適配體幾乎沒(méi)有生產(chǎn)批次之間的差異，便于日后的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。的化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，不易降解，對(duì)溫度不敏感，保存時(shí)間長(zhǎng)，即使變形也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)性，利于室溫下運(yùn)輸。

5)分子量小、穩(wěn)定性高。相對(duì)于抗體或酶，適配體的化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，不易降解，對(duì)溫度不敏感，保存時(shí)間長(zhǎng)，即使變形也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)性，利于室溫下運(yùn)輸。

6)應(yīng)用便捷。SELEX技術(shù)所獲得的適配體又被稱作是核酸型抗體，其優(yōu)于傳統(tǒng)抗體的性質(zhì)是沒(méi)有免疫原性，因此便能獲得一些低免疫原性甚至無(wú)免疫原性靶分子的適配體。并且還省去了傳統(tǒng)抗體制備過(guò)程中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而直接從體外文庫(kù)中獲取。而且適配體更容易通過(guò)細(xì)胞膜，并且沒(méi)有毒性，利于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的靶分子和實(shí)現(xiàn)多層次的調(diào)控，并能較快地被機(jī)體清除代謝掉，經(jīng)過(guò)特定的化學(xué)修飾后，還可使半衰期延長(zhǎng)，穩(wěn)定性提高，便于科學(xué)研究和疾病診治。

2SELEX技術(shù)的發(fā)展

目前SELEX技術(shù)出現(xiàn)了一些新的篩選方法，越來(lái)越多的與各種標(biāo)靶相對(duì)應(yīng)的適配體被篩選出來(lái)。如毛細(xì)管電泳法、硝酸纖維素膜過(guò)濾法、磁珠分離法、親和色譜法、Non-SELEX技術(shù)、無(wú)引物PCR-SELEX技術(shù)、微流體SELEX技術(shù)、生物芯片SELEX技術(shù)、原子力顯微鏡等各種新的模式也被應(yīng)用到適配體的篩選中。同時(shí)還出現(xiàn)了SELEX技術(shù)與定量PCR，SEL-EX技術(shù)與流式細(xì)胞儀、SELEX技術(shù)與ELISA的聯(lián)合應(yīng)用，更是極大的提升了篩選的效率和準(zhǔn)確性。

2．1消減SELEX技術(shù)消減

SELEX技術(shù)是一種經(jīng)過(guò)改良的SELEX技術(shù)。以完整細(xì)胞為靶標(biāo)的消減SELEX技術(shù)，是在篩選過(guò)程中以完整的細(xì)胞作為靶標(biāo)，并消減掉能與已知或未知的共有靶標(biāo)結(jié)合的配體，經(jīng)過(guò)消減后的次級(jí)隨機(jī)文庫(kù)再投入到特異靶標(biāo)的篩選中。它的意義在于可以實(shí)現(xiàn)從兩組高度同源的完整細(xì)胞中，篩選出針對(duì)其中一種細(xì)胞的特異性適配體。這項(xiàng)技術(shù)可應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤細(xì)胞識(shí)別結(jié)構(gòu)，還可進(jìn)一步作為“生物導(dǎo)彈”，獨(dú)立完成靶向治療或攜帶藥物，未來(lái)將會(huì)在腫瘤的治療中發(fā)揮巨大的功效。

2．2自動(dòng)化SELEX技術(shù)

傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)過(guò)程需要完成一套重復(fù)繁瑣的操作，使得篩選相對(duì)耗時(shí)耗力。自動(dòng)化SELEX技術(shù)的建立可以簡(jiǎn)化篩選過(guò)程，節(jié)約時(shí)間和物品的消耗，實(shí)現(xiàn)高通量和限定范圍，達(dá)到同時(shí)篩選多個(gè)靶分子的效果。自動(dòng)化SELEX技術(shù)離不開現(xiàn)代分離儀器的配合，后者的發(fā)展推動(dòng)了前者的進(jìn)步。2001年Cox等使用Biomek2000自動(dòng)化工作站成功篩選到了溶菌酶的特異性適配體，通過(guò)這種自動(dòng)化篩選平臺(tái)，不到2d就完成了12輪的篩選。

2．3導(dǎo)向SELEX技術(shù)

適配體的特異性是整個(gè)SELEX技術(shù)的核心所在，為了提高適配體的特異性和穩(wěn)定性，可將已知的能與靶標(biāo)非特異結(jié)合的分子摻入到文庫(kù)中或預(yù)先與靶標(biāo)進(jìn)行混合后再篩選，這樣可獲得只與靶標(biāo)特異結(jié)合的適配體。2002年Hamm等將此技術(shù)與抗個(gè)體基因型的方法聯(lián)合運(yùn)用，成功獲得了特定激酶抑制劑的特異性RNA適配體。Martell運(yùn)用特殊的導(dǎo)向SELEX技術(shù)，從隨機(jī)表達(dá)盒雜交文庫(kù)中篩選到了能與E2F蛋白具有高親和性的RNA適配體。

3SELEX技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

3．1SELEX技術(shù)在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

依據(jù)核酸適配體具有與靶物質(zhì)高特異性結(jié)合的能力，可以幫助我們尋找到疾病的發(fā)病機(jī)制。Roulet等提出把SELEX技術(shù)同基因表達(dá)串行分析手段聯(lián)合應(yīng)用，并通過(guò)自動(dòng)化的序列提取工藝，建立轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的定位模型。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子適配體文庫(kù)中的某一序列進(jìn)行測(cè)序，可了解該蛋白結(jié)合位點(diǎn)的特異性，探尋一些以前在基因組中從未研究過(guò)的結(jié)合位點(diǎn)，掌握在不同的核苷酸位點(diǎn)上非獨(dú)立堿基出現(xiàn)的先后順序，為闡明其結(jié)合機(jī)制提供一些線索。Bian-chi等采取SELEX技術(shù)發(fā)現(xiàn)，TRF1二聚體在端粒上有兩個(gè)相同的識(shí)別半位點(diǎn)，它們的距離可以變化，且兩個(gè)半位點(diǎn)的順序方向沒(méi)有區(qū)別。這為探索端粒長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新依據(jù)。

3．2SELEX技術(shù)在疾病診斷中的應(yīng)用

腫瘤細(xì)胞及其標(biāo)志物的早期檢測(cè)對(duì)于腫瘤的診斷及預(yù)后極為重要，目前已經(jīng)篩選出多種腫瘤的特異性適配體，例如急性髓系白血病的適配體KH1C12、急性淋巴細(xì)胞白血病的適配體sgc8/sgc3/sgd3、惡性膠質(zhì)瘤的適配體GBI-10、Burrkitt淋巴瘤的適配體TD05、非小細(xì)胞肺癌的適配體S1/S11e/S15、小細(xì)胞肺癌的適配體HCA12/HCC03/HCH07/HCH01、乳腺癌的適配體KMF2-1a、結(jié)腸癌的適配體KDED2/KD-ED7/KDED9/KC2D3、小鼠肝癌的適配體TLS9a/TLS11a、卵巢癌的適配體DOV3/DOV4/DOV6。它們可以特異地識(shí)別腫瘤細(xì)胞，僅需少量腫瘤細(xì)胞即可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的鑒別和分型。將適配體與納米顆粒結(jié)合后通過(guò)比色檢測(cè)，觀察顏色的變化即可判斷有無(wú)靶標(biāo)細(xì)胞。這個(gè)實(shí)驗(yàn)非常敏感，樣本中的靶細(xì)胞數(shù)超過(guò)百個(gè)即可檢測(cè)出來(lái)，還不需要昂貴的檢測(cè)設(shè)備和待檢靶標(biāo)的標(biāo)記與修飾。因此，有可能成為常規(guī)篩查活體標(biāo)本中新生腫瘤細(xì)胞的一種新方案。與此同時(shí)腫瘤細(xì)胞的分子成像技術(shù)也已經(jīng)問(wèn)世，它能夠從細(xì)胞水平對(duì)生物過(guò)程進(jìn)行可視化描述及測(cè)量，不僅能定位病灶，觀察某些影響腫瘤細(xì)胞行為的生物過(guò)程，還能觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)。Kim等研究將前列腺特異性膜抗原(PSMA)的特異性適配體與金納米材料結(jié)合后，帶有PSMA的前列腺癌細(xì)胞便能夠被特異性地標(biāo)記出來(lái)，將其作為造影劑應(yīng)用在前列腺腫瘤的影像學(xué)診斷中，比傳統(tǒng)的造影劑顯像時(shí)間更持久，毒副作用更小，應(yīng)用價(jià)值更顯著。SELEX技術(shù)還在血液的生化檢查方面，顯示出一定的應(yīng)用前景。用其檢測(cè)血液中的某些靶分子，將比傳統(tǒng)方法更特異和高效。腦尿鈉肽(BNP)常被臨床上用來(lái)評(píng)價(jià)急性心力衰竭或急性呼吸窘迫癥患者的病情和預(yù)后。Lin等采用SELEX技術(shù)的原理，篩選到了能與BNP特異結(jié)合的適配體。在微流體試驗(yàn)?zāi)Ｊ较�，被熒光�?biāo)記的適配體可以快速測(cè)出血液中BNP的濃度，比放射免疫分析法或是免疫分析技術(shù)更精確、更經(jīng)濟(jì)。C反應(yīng)蛋白(CRP)是機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下生成的一種非特異性的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，CRP與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病具相關(guān)性。Bini等開發(fā)出了一種帶有光化學(xué)性質(zhì)的CRP特異性適配體，當(dāng)血液中的CRP濃度超0．005mg/L時(shí)就能被檢測(cè)出來(lái)，敏感度非常高。這一成果為新型CRP診斷試劑的研制奠定了基礎(chǔ)。SELEX技術(shù)還被應(yīng)用在病原微生物的檢測(cè)，其能克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法在特異性和敏感性上的缺陷，為新型檢測(cè)試劑盒的開發(fā)提供有力支持。例如結(jié)合分支桿菌的特異性適配體CSRI2．11檢測(cè)過(guò)程比傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定法更省時(shí)更敏感;丙型肝炎病毒的適配體ZE2可結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)丙型肝炎的早期篩查，不受抗體檢測(cè)時(shí)窗口期的制約;瘧原蟲乳酸脫氫酶的適配體PL1在臨床實(shí)踐中，可以很好的區(qū)分患者是否感染了出間日瘧原蟲或惡性瘧原蟲。

3．3SELEX技術(shù)在疾病治療中的應(yīng)用

SELEX技術(shù)在疾病治療中的功效越來(lái)越來(lái)受到人們的重視。適配體在體內(nèi)與靶分子結(jié)合，理論上可以對(duì)靶分子的生理功能和代謝過(guò)程產(chǎn)生影響，靶分子也會(huì)因此發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)的改變甚至喪失原本的功能，直接或間接阻斷疾病發(fā)生進(jìn)程。以此開發(fā)的靶蛋白功能阻斷劑，日益顯示出其巨大的潛力。全球首個(gè)適配體藥物是2004年由美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)上市的哌加他尼鈉，可用來(lái)治療老年性黃斑變性。SELEX技術(shù)在凝血系統(tǒng)疾病的治療上具有一定的意義，已找到了可用作抗凝血和抗血栓藥物的適配體REG-1，其結(jié)合的位點(diǎn)是凝血酶的肝素結(jié)合位點(diǎn)以及纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn)。在治療免疫系統(tǒng)疾病方面，也已獲得了具有藥物開發(fā)潛力的特異性適配體，如可用來(lái)拮抗自身抗體已達(dá)到治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的適配體，還有能刺激T細(xì)胞釋放的4-1BB的適配體。對(duì)于腫瘤的治療，基于SELEX技術(shù)研制的適配體藥物更是走在前列，進(jìn)入到了臨床試驗(yàn)階段。如對(duì)實(shí)體瘤和復(fù)發(fā)性急性髓樣白血病有良好療效的AS1411，更出現(xiàn)了連接金納米棒的適配體，用作腫瘤靶向光熱治療。適配體藥物作為抗病毒藥，也展現(xiàn)出良好的前景，比如用來(lái)抑制狂犬病病毒的復(fù)制和干擾艾滋病病毒的體內(nèi)合成。除此以外，核酸適配體還可作為運(yùn)輸工具，特異性地把藥物運(yùn)送至靶標(biāo)細(xì)胞或組織達(dá)到定點(diǎn)清除的治療效果，研究比較成熟的有裝載著阿霉素，用來(lái)殺傷前列腺癌細(xì)胞的復(fù)合適配體藥物。

4展望

目前，越來(lái)越多可用于疾病診斷和治療的適配體被逐步篩選出來(lái)，并被廣泛地應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。然而其在臨床中的大規(guī)模應(yīng)用仍為時(shí)尚早。還有許多問(wèn)題亟須解決，例如具備高特異性、高親和力的適配體數(shù)目還相對(duì)較少;實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中篩選出的適配體，在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下發(fā)揮作用的實(shí)際效果尚不完全掌握;篩選過(guò)程還需進(jìn)一步簡(jiǎn)化，產(chǎn)物的特異性和穩(wěn)定性還應(yīng)進(jìn)一步提高，以及對(duì)適配體的修飾和優(yōu)化方案還需進(jìn)一步明確。相信隨著現(xiàn)代技術(shù)的進(jìn)步，上述各種問(wèn)題終將攻克，SELEX技術(shù)在生命科學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用前景將會(huì)更加廣闊。

作者：樸喜航任姝穎夏薇單位：北華大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院