微生物生長(zhǎng)的常用檢測(cè)方法

　　微生物包括：細(xì)菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、顯微藻類等在內(nèi)的一大類生物群體，它個(gè)體微小，與人類關(guān)系密切。下面是小編收集整理的微生物生長(zhǎng)的幾種檢測(cè)方法，希望對(duì)您有所幫助！

　　一、生長(zhǎng)量測(cè)定法

　　1.1體積測(cè)量法：又稱測(cè)菌絲濃度法。

　　通過(guò)測(cè)定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來(lái)反映微生物的生長(zhǎng)狀況。方法是，取一定量的待測(cè)培養(yǎng)液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間（如5分鐘）和轉(zhuǎn)速（如5000rpm），離心后，倒出上清夜，測(cè)出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測(cè)定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的一個(gè)重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。這種方法比較粗放，簡(jiǎn)便，快速，但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營(yíng)養(yǎng)物，結(jié)果會(huì)有一定偏差。

　　1.2稱干重法：

　　可用離心或過(guò)濾法測(cè)定。一般干重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測(cè)培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速，進(jìn)行離心，并用清水離心洗滌1-5次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用紅外線烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后稱重。如用過(guò)濾法，絲狀真菌可用濾紙過(guò)濾，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后用少量水洗滌，在40℃下進(jìn)行真空干燥。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí)，常采用這種方法，如活性干酵母（activitydryyeast,ADY）,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。

　　1.3比濁法：

　　微生物的生長(zhǎng)引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定一定波長(zhǎng)下的吸光值，判斷微生物的生長(zhǎng)狀況。對(duì)某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長(zhǎng)作定時(shí)跟蹤時(shí)，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計(jì)的比色座孔中，即可隨時(shí)測(cè)定其生長(zhǎng)情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)。如我所使用UNICO公司的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)600nm處用比色管定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光光度值OD600，以此監(jiān)控E.Coli的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)時(shí)間。

　　1.4菌絲長(zhǎng)度測(cè)量法：

　　對(duì)于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基上測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)菌絲生長(zhǎng)的長(zhǎng)度，或是利用一只一端開(kāi)口并帶有刻度的細(xì)玻璃管，到入合適

　　的培養(yǎng)基，臥放，在開(kāi)口的一端接種微生物，一段時(shí)間后記錄其菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，借此衡量絲狀微生物的生長(zhǎng)

　　二、微生物計(jì)數(shù)法

　　2.1血球計(jì)數(shù)板法:

　　血球計(jì)數(shù)板是一種有特別結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái)，兩嵴的表比兩平臺(tái)的表面高0.1mm，每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央0.1mm2面積上刻有400個(gè)小方格。通過(guò)油鏡觀察，統(tǒng)計(jì)一定大格內(nèi)微生物的數(shù)量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數(shù)。這種方法簡(jiǎn)便，直觀，快捷，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。

　　2.2染色計(jì)數(shù)法：

　　為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù)，而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無(wú)法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法。借助不同的染料對(duì)菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧�，可以更方便的在顯微鏡下進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。如酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)可用美藍(lán)染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為無(wú)色，而死細(xì)胞為藍(lán)色。

　　2.3比例計(jì)數(shù)法：

　　將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細(xì)胞）濃度的液體與一待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。這種計(jì)數(shù)方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn)。

　　2.4液體稀釋法：

　　對(duì)未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計(jì)數(shù)，從最適宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù)，然后查最大或然數(shù)表MPN（mostprobablynumber）得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測(cè)，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

　　2.5平板菌落計(jì)數(shù)法：

　　這是一種最常用的活菌計(jì)數(shù)法。將待測(cè)菌液進(jìn)行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合，或?qū)⒕�液涂布于已凝固的固體培養(yǎng)基平板上。保溫培養(yǎng)后，用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù)。一般以直徑9cm的平板上出現(xiàn)50-500個(gè)菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。

　　2.6試劑紙法：

　　在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無(wú)色）待蘸取測(cè)試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)一定密度的玫瑰色微小菌落與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確，相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差。

　　2.7膜過(guò)濾法：

　　用特殊的濾膜過(guò)濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光。

　　2.8生理指標(biāo)法：

　　微生物的生長(zhǎng)伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量，含糖量，產(chǎn)氣量等，與生長(zhǎng)量相平行的生理指標(biāo)很多，它們可作為生長(zhǎng)測(cè)定的相對(duì)值。

　　2.9測(cè)定含氮量：

　　大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，即可測(cè)定粗蛋白的含量。含氮量的測(cè)定方法有很多，如用硫酸，過(guò)氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測(cè)N2氣法。Dumas測(cè)N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮?dú)猓�收集在呼吸�?jì)中，用KOH吸去CO2后即可測(cè)出N2的量。

　　2.10測(cè)定含碳量：

　　將少量（干重0.2-2.0mg）生物材料混入1毫升水或無(wú)機(jī)緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長(zhǎng)下讀取吸光光度值，即可推算出生長(zhǎng)量。需用試劑做空白對(duì)照，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　2.11還原糖測(cè)定法：

　　還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過(guò)還原糖的測(cè)定可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的常規(guī)監(jiān)測(cè)。方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液，繼續(xù)加Na2S2O3至終點(diǎn)，查表讀出還原糖的含量。

　　2.12氨基氮的測(cè)定：

　　方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應(yīng)數(shù)刻，加入0.02N的使之變色，根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況。

　　2.13其他生理物質(zhì)的測(cè)定：

　　P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，產(chǎn)CO2（用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)），耗氧，黏度，產(chǎn)熱等指標(biāo)，都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，最終產(chǎn)氣量，微生物活性三方面的測(cè)定反映微生物的生長(zhǎng)。如我所在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上，隨時(shí)監(jiān)測(cè)溶氧量的變化和酸堿度的變化，判斷細(xì)菌的長(zhǎng)勢(shì)。

　　拓展：微生物的現(xiàn)代定義

　　肉眼難以看清，需要借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的一切微小生物的總稱。微生物包括細(xì)菌、病毒、真菌和少數(shù)藻類等。（但有些微生物是肉眼可以看見(jiàn)的，像屬于真菌的蘑菇、靈芝等。）病毒是一類由核酸和蛋白質(zhì)等少數(shù)幾種成分組成的“非細(xì)胞生物”，但是它的生存必須依賴于活細(xì)胞。根據(jù)存在的不同環(huán)境分為空間微生物、海洋微生物等，按照細(xì)胞結(jié)構(gòu)分類分為原核微生物和真核微生物。

　　微生物的主要特征

　　體小面大

　　一個(gè)體積恒定的物體，被切割的越小，其相對(duì)表面積越大。微生物體積很小，如一個(gè)典型的球菌，其體積約1mm，可是其表面積卻很大。這個(gè)特征也是賦予微生物其他如代謝快等特性的基礎(chǔ)。

　　吸多轉(zhuǎn)快

　　微生物通常具有極其高效的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化能力。據(jù)研究，乳糖菌在1個(gè)小時(shí)之內(nèi)能夠分解其自身重量1000-10000倍的乳糖，產(chǎn)朊假絲酵母菌的蛋白合成能力是大豆蛋白合成能力的100倍。

　　生長(zhǎng)繁殖快

　　相比于大型動(dòng)物，微生物具有極高的生長(zhǎng)繁殖速度。大腸桿菌能夠在12.5-20分鐘內(nèi)繁殖1次。不妨計(jì)算一下，1個(gè)大腸桿菌假設(shè)20分鐘分裂1次，1小時(shí)3次，1晝夜24小時(shí)分裂24×3=72次，大概可產(chǎn)生4722366500萬(wàn)億個(gè)（2的72次方），這是非常巨大的數(shù)字。但事實(shí)上，由于各種條件的限制，如營(yíng)養(yǎng)缺失、競(jìng)爭(zhēng)加劇、生存環(huán)境惡化等原因，微生物無(wú)法完全達(dá)到這種指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。 已知大多數(shù)微生物生長(zhǎng)的最佳pH范圍為7.0 (6.6~7.5)附近，部分則低于4.0。

　　微生物的這一特性使其在工業(yè)上有廣泛的應(yīng)用，如發(fā)酵、單細(xì)胞蛋白等。微生物是人類不可或缺的好朋友。

　　適應(yīng)強(qiáng) 易變異

　　分布廣 種類多

　　微生物對(duì)我們生活的影響

　　微生物對(duì)人類最重要的影響之一是導(dǎo)致傳染病的流行。在人類疾病中有50%是由病毒引起。微生物導(dǎo)致人類疾病的歷史，也就是人類與之不斷斗爭(zhēng)的歷史。在疾病的預(yù)防和治療方面，人類取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是新現(xiàn)和再現(xiàn)的微生物感染還是不斷發(fā)生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治療藥物。一些疾病的致病機(jī)制并不清楚。大量的廣譜抗生素的濫用造成了強(qiáng)大的選擇壓力，使許多菌株發(fā)生變異，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，人類健康受到新的威脅。一些分節(jié)段的病毒之間可以通過(guò)重組或重配發(fā)生變異，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都與前次導(dǎo)致感染的株型發(fā)生了變異，這種快速的變異給疫苗的設(shè)計(jì)和治療造成了很大的障礙。而耐藥性結(jié)核桿菌的出現(xiàn)使原本已近控制住的結(jié)核感染又在世界范圍內(nèi)猖獗起來(lái)。

　　微生物千姿百態(tài)，有些是腐敗性的，即引起食品氣味和組織結(jié)構(gòu)發(fā)生不良變化。當(dāng)然有些微生物是有益的，它們可用來(lái)生產(chǎn)如奶酪，面包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必須通過(guò)顯微鏡放大約1000 倍才能看到。比如中等大小的細(xì)菌，1000個(gè)疊加在一起只有句號(hào)那么大。

　　微生物能夠致病，能夠造成食品、布匹、皮革等發(fā)霉腐爛，但微生物也有有益的一面。最早是弗萊明從青霉菌抑制其它細(xì)菌的生長(zhǎng)中發(fā)現(xiàn)了青霉素，這對(duì)醫(yī)藥界來(lái)講是一個(gè)劃時(shí)代的發(fā)現(xiàn)。后來(lái)大量的抗生素從放線菌等的`代謝產(chǎn)物中篩選出來(lái)�？股�素的使用在第二次世界大戰(zhàn)中挽救了無(wú)數(shù)人的生命。一些微生物被廣泛應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵，生產(chǎn)乙醇、食品及各種酶制劑等；一部分微生物能夠降解塑料、處理廢水廢氣等等，并且可再生資源的潛力極大，稱為環(huán)保微生物；還有一些能在極端環(huán)境中生存的微生物，例如：高溫、低溫、高鹽、高堿以及高輻射等普通生命體不能生存的環(huán)境，依然存在著一部分微生物等等�？瓷先�，我們發(fā)現(xiàn)的微生物已經(jīng)很多，但實(shí)際上由于培養(yǎng)方式等技術(shù)手段的限制，人類現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的微生物還只占自然界中存在的微生物的很少一部分。

　　微生物間的相互作用機(jī)制也相當(dāng)奧妙。例如健康人腸道中即有大量細(xì)菌存在，稱為正常菌群，其中包含的細(xì)菌種類高達(dá)上百種。在腸道環(huán)境中這些細(xì)菌相互依存，互惠共生。食物、有毒物質(zhì)甚至藥物的分解與吸收，菌群在這些過(guò)程中發(fā)揮的作用，以及細(xì)菌之間的相互作用機(jī)制還不明了。一旦菌群失調(diào)，就會(huì)引起腹瀉。

　　隨著醫(yī)學(xué)研究進(jìn)入分子水平，人們對(duì)基因、遺傳物質(zhì)等專業(yè)術(shù)語(yǔ)也日漸熟悉。人們認(rèn)識(shí)到，是遺傳信息決定了生物體具有的生命特征，包括外部形態(tài)以及從事的生命活動(dòng)等等，而生物體的基因組正是這些遺傳信息的攜帶者。因此闡明生物體基因組攜帶的遺傳信息，將大大有助于揭示生命的起源和奧秘。

　　工業(yè)微生物涉及食品、制藥、冶金、采礦、石油、皮革、輕化工等多種行業(yè)。通過(guò)微生物發(fā)酵途徑生產(chǎn)抗生素、丁醇、維生素C以及一些風(fēng)味食品的制備等；某些特殊微生物酶參與皮革脫毛、冶金、采油采礦等生產(chǎn)過(guò)程，甚至直接作為洗衣粉等的添加劑；另外還有一些微生物的代謝產(chǎn)物可以作為天然的微生物殺蟲(chóng)劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌的基因組研究，發(fā)現(xiàn)了一系列與抗生素及重要工業(yè)用酶的產(chǎn)生相關(guān)的基因。乳酸桿菌作為一種重要的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑參與食品發(fā)酵過(guò)程，對(duì)其進(jìn)行的基因組學(xué)研究將有利于找到關(guān)鍵的功能基因，然后對(duì)菌株加以改造，使其更適于工業(yè)化的生產(chǎn)過(guò)程。國(guó)內(nèi)維生素C兩步發(fā)酵法生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵菌株氧化葡萄糖酸桿菌的基因組研究，將在基因組測(cè)序完成的前提下找到與維生素C生產(chǎn)相關(guān)的重要代謝功能基因，經(jīng)基因工程改造，實(shí)現(xiàn)新的工程菌株的構(gòu)建，簡(jiǎn)化生產(chǎn)步驟，降低生產(chǎn)成本，繼而實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益的大幅度提升。對(duì)工業(yè)微生物開(kāi)展的基因組研究，不斷發(fā)現(xiàn)新的特殊酶基因及重要代謝過(guò)程和代謝產(chǎn)物生成相關(guān)的功能基因，并將其應(yīng)用于生產(chǎn)以及傳統(tǒng)工業(yè)、工藝的改造，同時(shí)推動(dòng)現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展。

　　經(jīng)濟(jì)作物柑橘的致病菌是國(guó)際上第一個(gè)發(fā)表了全序列的植物致病微生物。還有一些在分類學(xué)、生理學(xué)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值上非常重要的農(nóng)業(yè)微生物，例如：胡蘿卜歐文氏菌、植物致病性假單胞菌以及中國(guó)正在開(kāi)展的黃單胞菌的研究等正在進(jìn)行之中。日前植物固氮根瘤菌的全序列也剛剛測(cè)定完成。借鑒已經(jīng)較為成熟的從人類病原微生物的基因組學(xué)信息篩選治療性藥物的方案，可以嘗試性地應(yīng)用到植物病原體上。特別像柑橘的致病菌這種需要昆蟲(chóng)媒介才能完成生活周期的種類，除了殺蟲(chóng)劑能阻斷其生活周期以外，只能通過(guò)遺傳學(xué)研究找到毒力相關(guān)因子，尋找抗性靶位以發(fā)展更有效的控制對(duì)策。固氮菌全部遺傳信息的解析對(duì)于開(kāi)發(fā)利用其固氮關(guān)鍵基因提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量也具有重要的意義。[10]

　　在極端環(huán)境下能夠生長(zhǎng)的微生物稱為極端微生物，又稱嗜極菌。嗜極菌對(duì)極端環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，極端微生物基因組的研究有助于從分子水平研究極限條件下微生物的適應(yīng)性，加深對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)。