dna聚合酶的特點及其作用

　　DNA聚合酶(DNA polymerase)是細胞復(fù)制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5'端點開始復(fù)制到3'端的酶。下面是小編精心收集的dna聚合酶的特點及其作用，希望能對你有所幫助。

　　dna聚合酶的特點：

　　[1]以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA;

　　[2]需要模板和引物的存在;

　　[3]不能起始合成新的DNA鏈;

　　[4]催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3'-OH末端;

　　[5]催化DNA合成的方向是5'→3'。

　　dna聚合酶的作用：

　　[1]聚合作用：在引物RNA'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。dNTP進入結(jié)合位點后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進3'-OH與5'-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯誤的核苷酸進入結(jié)合位點，則不能與模板配對，無法改變酶的構(gòu)象而被3'-5'外切酶活性位點所識別并切除之。

　　[2]3'→5'外切酶活性──校對作用：這種酶活性的主要功能是從3'→5'方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。當(dāng)反應(yīng)體系中沒有反應(yīng)底物dNTP時，由于沒有聚合作用而出現(xiàn)暫時的游離現(xiàn)象，從而被3'→5'外切酶活性所降解。如果提高反應(yīng)體系的溫度可以促進這種作用，這表明溫度升高使DNA生長鏈3'末端與模板發(fā)生分離的機會更多，因而降解作用加強。當(dāng)向反應(yīng)體系加入dNTP，而且只加放與模板互補的上述核苷酸才會使這種外切酶活性受到抑制，并繼續(xù)進行DNA的合成。由此推論，3'→5'外切酶活性的主要功能是校對作用，當(dāng)加入的核苷酸與模板不互補而游離時則被3'→5'外切酶切除，以便重新在這個位置上聚合對應(yīng)的核苷酸。在某些T4噬菌體突變株中DNA復(fù)制的真實性降低，而易發(fā)生突變，從此突變株分離得到的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突變能力的T4突變株中的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復(fù)制真實性好，變異率低�？梢�，3'→5'外切酶活性對DNA復(fù)制真實性的維持是十分重要的。

　　[3]5'→3'外切酶活性──切除修復(fù)作用：5'→3'外切酶活性就是從5'→3'方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5'-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部分(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10個核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力達10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對岡崎片段5'末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性。

　　[4]焦磷酸解作用：DNApolⅠ的這種活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無機焦磷酸分解DNA生長鏈，可以認為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi←(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA

　　[5]焦磷酸交換作用：催化dNTP末端的PPi同無機焦磷酸的交換反應(yīng)。

　　反應(yīng)式為32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA

　　最后兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內(nèi)由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。

　　DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進，即沒有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。這種反應(yīng)叫缺口平移(Nick translation)。當(dāng)雙鏈DNA上某個磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生切口時，DNApoIⅠ能從切口開始合成新的DNA鏈，同時切除原來的舊鏈。這樣，從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛�磷酸為�?32P-dNTP，則重新合成的`新鏈即為帶有同位素標記的DNA分子，可以用作探針進行分子雜交實驗。

　　盡管DNApolⅠ是第一個被鑒定的DNA聚合酶，但它不是在腸桿菌中DNA復(fù)制的主要聚合酶。主要證據(jù)如下：

　　[1]純化的DNApolⅠ催化dNTP摻入的速率為667堿基/分，而體內(nèi)DNA合成速率要比此高二倍數(shù)量級;

　　[2]大腸桿菌的一個突變株中，此酶的活力正常，但染色體DNA復(fù)制不正常;

　　[3]而在另一些突變株中，DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%，但是DNA復(fù)制卻正常，而且此突變株增加了對紫外線、烷化劑等突變因素的敏感性。這表明該酶與DNA復(fù)制關(guān)系不大，而在DNA修復(fù)中起著重要的作用。

　　實驗室常用的耐熱DNA聚合酶：

　　耐熱DNA聚合酶多應(yīng)用在PCR技術(shù)中。各種耐熱DNA聚合酶均具有5'-3'聚合酶活性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除錯配，切平末端;5'-3'外切酶活性可以消除合成障礙。由于上述這些不同，可以將耐熱DNA聚合酶分為三類：

　　一、普通耐熱DNA聚合酶

　　Taq DNA 聚合酶

　　由一種水生棲熱菌yT1株分離提取出，是發(fā)現(xiàn)的耐熱DNA聚合酶中活性最高的一種，達200,000單位/mg。具有5'-3'外切酶活性，但不具有3'-5'外切酶活性，因而在合成中對某些單核苷酸錯配沒有校正功能。

　　TaqDNA聚合酶還要具有非模板依賴性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈3'加入單核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3'突出的單A核苷酸尾;另一方面，在僅有dTTP存在時，它可將平端的質(zhì)粒的3'端加入單T核苷酸尾，產(chǎn)生3'端突出的單T核苷酸尾。應(yīng)用這一特性，可實現(xiàn)PCR產(chǎn)物的T-A克隆法。

　　Tth DNA 聚合酶

　　從Thermus thermophilus HB8中提取而得，該酶在高溫和MnCl2條件下，能有效地逆轉(zhuǎn)錄RNA;當(dāng)加入Mg2+后，該酶的聚合活性大大增加，從而使cDNA合成與擴增可用一種酶催化。

　　二、高保真DNA聚合酶

　　pfu DNA 聚合酶

　　是從Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高溫DNA聚合酶，它不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可校正PCR擴增過程中產(chǎn)生的錯誤，使產(chǎn)物的堿基錯配率極低。PCR產(chǎn)物為平端，無3'端突出的單A核苷酸。

　　Vent DNA 聚合酶

　　該酶是從Litoralis棲熱球菌中分離出的，不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可以去除錯配的堿基，具有校對功能。

　　三、DNA序列測定中應(yīng)用的耐熱DNA聚合酶

　　Promega公司測序級TaqDNA聚合酶

　　是在TaqDNA聚合酶的基礎(chǔ)上對它進行修飾，去除5'-3'外切酶活性，保證測序記過的高度準確性，可產(chǎn)生強度均一的測序條帶，背景清晰。

　　Bca Best DNA 聚合酶

　　從Bacillus Caldotenax YT-G菌株中提純，并使其5'-3'外切酶活性缺失的DNA聚合酶。它的伸長性能優(yōu)越;可抑制DNA二級結(jié)構(gòu)形成，可以得到均一的DNA測序帶。

　　Sac DNA 聚合酶

　　從酸熱浴流化裂片菌中分離，無3'-5'外切酶活性，可用于DNA測序，但測序反應(yīng)中ddNTP/dNTP的比率要高。