分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

　　分子生物學(xué)（molecular biology)是從分子水平研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能從而闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學(xué)。下面是小編帶來的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，希望對(duì)你有幫助。

　　實(shí)驗(yàn)1總DNA提取

　　生物總DNA的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要內(nèi)容。由于不同的生物材料細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同，而細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞是提取總DNA的關(guān)鍵步驟。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)也根據(jù)生物種類的不同而有差異，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根據(jù)具體的情況來設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法。本實(shí)驗(yàn)介紹采用CTAB法提取植物總DNA的技術(shù)。

　　[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯

　　學(xué)習(xí)和掌握學(xué)習(xí)CTAB法提取植物總DNA的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。學(xué)習(xí)和掌握紫外光吸收法鑒定DNA的純度和濃度。

　　[實(shí)驗(yàn)原理]

　　植物葉片經(jīng)液氮研磨，可使細(xì)胞壁破裂，加入去污劑（如CTAB），可使核蛋白體解析，然后使蛋白和多糖雜質(zhì)沉淀，DNA進(jìn)入水相，再用酚、氯仿抽提純化。本實(shí)驗(yàn)采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一種非離子去污劑，能溶解膜蛋白與脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的處理下，結(jié)合65℃水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA被釋放出來。CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（>0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)過氯仿/異戊醇(24:1)抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來純化DNA，最后經(jīng)異丙醇或乙醇等沉淀劑將DNA沉淀分離出來。

　　由于核酸、蛋白質(zhì)、多糖在特定的紫外波長都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。純的DNA樣品A260/280≈1.8，純的RNA樣品A260/280≈2.0，并且1μg/mlDNA溶液A260=0.020。

　　[實(shí)驗(yàn)器材]

　　1、高壓滅菌鍋2、冰箱3、恒溫水浴鍋4、高速冷凍離心機(jī)5、紫外分光光度計(jì)6、剪刀7、陶瓷研缽和杵子8、磨口錐形瓶（50ml）9、滴管10、細(xì)玻棒11、小燒杯（50ml）12、離心管（50ml）13、植物材料

　　[實(shí)驗(yàn)試劑]

　　1、3×CTABbuffer（pH8.0）

　　100mMTris

　　25mMEDTA

　　1.5MNaCl

　　3%CTAB

　　2%β-巰基乙醇

　　2、TE緩沖液（pH8.0）

　　10mmol/LTris·HCl

　　1mmol/LEDTA

　　3、氯仿-異戊醇混合液（24：1，V/V）

　　4、95％乙醇

　　5、液氮

　　[實(shí)驗(yàn)步驟]

　　1、稱取2g新鮮的植物葉片，用蒸餾水沖洗葉面，濾紙吸干水分。

　　2、將葉片剪成1cm長，置預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快研磨成粉末。

　　3、待液氮蒸發(fā)完后，加入15mL預(yù)熱（60℃）的CTAB提取緩沖液，轉(zhuǎn)入一磨口錐形瓶中，

　　置于65℃水浴保溫0.5h，不時(shí)地輕輕搖動(dòng)混勻。

　　4、加等體積的氯仿/異戊醇，蓋上瓶塞，溫和搖動(dòng)，使成乳狀液。

　　5、將錐形瓶中的液體倒入50ml離心管中，在4℃下8000rpm離心10min。

　　6、離心管中出現(xiàn)3層，用滴管小心地將上層清液吸入另一干凈的離心管中，棄去中間層的細(xì)胞碎片和變性蛋白以及下層的氯仿。（根據(jù)需要，上清液可用氯仿/異戊醇反復(fù)提取多次。）

　　7、收集上層清液，并將其倒入小燒杯。沿?zé)�杯壁慢慢加�?倍體積預(yù)冷的95％乙醇。邊加邊用細(xì)玻棒沿同一方向攪動(dòng)，可看到纖維狀的沉淀（主要為DNA）迅速纏繞在玻棒上。

　　8、小心取下這些纖維狀沉淀，加1～2mL70%乙醇沖洗沉淀，輕搖幾分鐘，除去乙醇，即為DNA粗制品。

　　9、將粗制品溶于TE緩沖液。

　　10、在分光光度計(jì)上測定該溶液在260nm/280nm紫外光波長下的光密度值。

　　[注意事項(xiàng)]

　　1、液氮研磨時(shí)，小心操作，以免凍傷。

　　2、所有操作均需溫和，避免劇烈震蕩。

　　[思考題]

　　CTAB、EDTA、巰基乙醇的作用分別是什么？

　　液氮研磨的原理是什么？

　　實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒DNA的提取

　　質(zhì)粒DNA是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用的載體分子。質(zhì)粒是細(xì)菌獨(dú)立于染色體外的遺傳物質(zhì)，是環(huán)狀的雙鏈DNA分子。由于質(zhì)粒比較小，并且能進(jìn)行獨(dú)立的'自我復(fù)制，常常被改造為克隆和表達(dá)的載體分子。

　　[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯

　　通過本實(shí)驗(yàn)掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的基本原理，掌握堿裂解小量提取質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

　　[實(shí)驗(yàn)原理]

　　堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH值介于12.0~12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會(huì)那么迅速

　　而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。

　　[實(shí)驗(yàn)器材]

　　1、恒溫培養(yǎng)箱

　　2、恒溫?fù)u床

　　3、臺(tái)式離心機(jī)

　　4、高壓滅菌鍋

　　5、Tip頭、Eppendorg管

　　6、含有目的質(zhì)粒的E.coli菌株

　　[實(shí)驗(yàn)試劑]

　　1、溶液I

　　50mmol/L葡萄糖

　　5mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl

　　10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

　　2、溶液II

　　0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等體積混合

　　3、溶液III

　　5mol/L乙酸鉀60mL

　　冰乙酸11.5mL

　　水28.5mL

　　4、TE緩沖液

　　10mmol/LTris·HCl

　　1mmol/LEDTA(pH8.0)

　　5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

　　6、EcoRI及其緩沖液

　　7、HindIII及其緩沖液

　　[實(shí)驗(yàn)步驟]

　　1、將含有目的質(zhì)粒的E.coli菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

　　2、取1ml培養(yǎng)物倒入Eppendorf管中，12000r/min離心30sec。

　　3、吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。

　　4、將細(xì)菌沉淀懸浮于100μL冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩。

　　5、加200μL溶液II（新鮮配制），蓋緊管皿，快速顛倒5次，混勻內(nèi)容物，將Eppendorf管放在冰上。

　　6、加入150μL溶液III（冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻，冰上放置5min。7、12000r/min，離心5min，將上清液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中。

　　8、向上清液加入等體積的飽和酚，混勻。

　　9、12000r/min，離心5min，將上清液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中。

　　10、向上清液加入2倍體積乙醇，混勻后，室溫放置5~10min。12000r/min離心5min。倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水紙上，吸干液體。

　　11、1ml70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。12、20μLTE緩沖液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

　　[注意事項(xiàng)]

　　操作時(shí)，避免劇烈震蕩。

　　[思考題]

　　1、實(shí)驗(yàn)操作中，飽和酚的作用是什么？

　　2、SDS和NaOH的作用是什么？

　　[參考文獻(xiàn)]

　　《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》（第四版）

　　[美]FM奧斯伯，RE金斯頓等主編科學(xué)出版社2005

　　實(shí)驗(yàn)三總RNA提取　　

　　1．掌握樣品中總RNA的提取的原理和方法。

　　2．熟悉RNA純度及濃度檢測方法。

　　3．了解RNA提取過程中的注意事項(xiàng)。

　　RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物，存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對(duì)RNA進(jìn)行操作在分子生物學(xué)中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA是很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所必需的，如Northern雜交、cDNA合成及體外翻譯等實(shí)驗(yàn)的成敗，在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。由于細(xì)胞內(nèi)的大部分RNA是以核蛋白復(fù)合體的形式存在，所以在提取RNA時(shí)要利用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑，迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與RNA分離，釋放出RNA。再通過酚、氯仿等有機(jī)溶劑處理、離心，使RNA與其他細(xì)胞組分分離，得到純化的總RNA。在提取的過程中要抑制內(nèi)源和外源的RNase活性，保護(hù)RNA分子不被降解。因此提取必須在無RNase的環(huán)境中進(jìn)行。可使用RNase抑制劑，如DEPC是RNase的強(qiáng)抑制劑，常用來抑制外源RNase活性。提取緩沖液中一般含SDS、酚、氯仿、胍鹽等蛋白質(zhì)變性劑，也能抑制RNase活性，并有助于除去非核酸成分。

　　1．總RNA提取的基本原理和常用方法介紹

　　2．進(jìn)行動(dòng)物組織或血液樣品總RNA提取。

　　3．對(duì)提取的RNA的進(jìn)行純度和濃度檢測。

　　超凈工作臺(tái)、高速冷凍離心機(jī)、電泳儀、紫外分光光度計(jì)、凝膠成像系統(tǒng)、振蕩器、移液器、吸頭、Ep管、玻璃勻漿器、試管。

　　玻璃器皿洗凈后置180℃烘烤8h；不耐高溫的器皿（如塑料制品）應(yīng)用0.1%DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高壓20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。

　　細(xì)胞裂解液：異硫氰酸胍4mol/L；檸檬酸鈉（pH7.0）25mmol/L；十二烷基肌氨酸鈉0.5%；β-巰基乙醇0.1mol/L（稱取檸檬酸鈉0.64g，十二烷基肌氨酸鈉0.415g，吸取β-巰基乙醇0.7ml，用無Rnase的蒸餾水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，異硫氰酸胍25g,混合，完全溶解后4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

　　TRIzolRNA抽提試劑、2mol醋酸鈉、0.1%DEPC、平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）、氯仿、無水乙醇、異丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水。

　�。ㄒ唬┊惲蚯杷犭曳ǎ≒LT）

　　1．取新鮮動(dòng)物組織0.1～0.2g置于組織勻漿器中，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液1ml,在冰浴

　　中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然后將細(xì)胞懸浮液吸入另一試管中。

　　2．加入2mol醋酸鈉（pH4.0）120μl，充分混勻。

　　3．加入1.2ml酚：氯仿：異戊醇，充分混勻搖振10s，冰浴15min。

　　4．將混合物轉(zhuǎn)移至1.5mlEp管中，4℃，離心10000r/min,20min.

　　5．移取上層水相至另一Ep管中，加入等體積的異丙醇，靜置-20℃，30min沉淀RNA.

　　6．4℃，離心12000r/min，15min.

　　7．棄上清液，加入70%乙醇400μl,洗滌RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被懸浮，則4℃離心10000r/min，10min。

　　8．棄上清液，自然干燥，但應(yīng)避免沉淀完全干燥，否則RNA難以溶解。

　　9．加入100μl無RNase水重懸RNA，或加1ml無水乙醇和1/10體積3mol醋酸鈉（pH4.0），-70℃保存。

　�。ǘ�）TrizolReagent/總RNA提取試劑

　　TRIzol是從細(xì)胞和組織中提取總RNA的即用型試劑，在樣品裂解或勻漿過程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相，用異丙醇可沉淀回收RNA。下面介紹由上海美季生物技術(shù)有限公司總RNA提取試劑推薦的操作步驟：

　　1.勻漿處理（Homogenization）

　　（1）組織中提取總RNA

　�、僦参锝M織：植物葉片直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物葉片加入1mlTRIzol。

　　②動(dòng)物組織：按10-30mg組織加入1mlTRIzol，用電動(dòng)勻漿器或者一次性研磨杵充分勻漿。

　�。�2）培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA

　　①貼壁細(xì)胞：無須胰酶消化，可直接用TRIzol進(jìn)行裂解，每10平方厘米培養(yǎng)面積加1mlTRIzol。

　�、趹腋〖�(xì)胞：可直接離心收集、裂解，每1mlTRIzol可裂解5×106動(dòng)物或酵母細(xì)胞，或107細(xì)菌細(xì)胞。

　�。�3）血液中提取總RNA

　　直接取新鮮的血液，加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫放置10分鐘，10,000rpm離心1分鐘。徹底吸棄上清，收集白細(xì)胞沉淀。每100-200μl血液收集的白細(xì)胞沉淀加入1mlTRIzol。

　　2．分層（PhaseSeparation）

　　（1）樣品加入TRIzol后，室溫放置5min，使樣品充分裂解。

　　注：如不進(jìn)行下一步操作，樣品可放入-70℃長期保存。