真菌培養(yǎng)及鑒定方法有哪些

　　真菌的營養(yǎng)要求不向。在一般細(xì)菌培養(yǎng)基上均能生長。真菌培養(yǎng)及鑒定有哪些的呢?本文是小編整理真菌培養(yǎng)及鑒定的資料，僅供參考。

　　真菌培養(yǎng)及鑒定

　　1.采集標(biāo)本 體表真菌的標(biāo)本有毛發(fā)、皮屑、甲屑、痂等，標(biāo)本在分離前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌的標(biāo)本可根據(jù)情況取痰、尿液、糞便、膿液、口腔或陰-道分泌物、血液、腦脊液、各種穿刺液和活檢組織，采集標(biāo)本應(yīng)注意無菌操作。

　　2.培養(yǎng)檢查：可提高真菌檢出率，并能確定菌種。標(biāo)本接種于葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud agar)上，置室溫或37℃培養(yǎng)1～3周。必要時可行小培養(yǎng)協(xié)助鑒定。菌種鑒定常根據(jù)菌落的形態(tài)及顯微鏡下形態(tài)判斷。對某些真菌，有時尚需配合其他鑒別培養(yǎng)基、生化反應(yīng)、分子生物學(xué)方法確定。

　　真菌培養(yǎng)的方法與直接鏡檢法相比較而言，更能對大部分真菌感染的灰指甲作出準(zhǔn)確的鑒定，也是診斷灰指甲的一個很重要的手段。下面我們就從培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)時間、菌種鑒定三方面來了解一下灰指甲的真菌培養(yǎng)法。

　　1.培養(yǎng)基的選擇

　　通常培養(yǎng)真菌會同時選用兩種培養(yǎng)基，如果單用一種培養(yǎng)基，則容易忽略其它種類的真菌診斷。常見的兩種培養(yǎng)基，一種為沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中加抗菌劑，常為氯霉素和放線菌酮;另一種是沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中僅加氯霉素，不加放線菌酮。

　　2.培養(yǎng)時間

　　各種真菌的生長速度不同，所以報告的時間也不同。一般皮膚癬菌生長較緩慢，在26℃-28℃的環(huán)境下需要培養(yǎng)2-4周才能發(fā)報告，但是，皮膚癬菌含蓋的菌種較多也需要區(qū)別對待;酵母菌生長較快，通常2-3就可以發(fā)報告，如果為陰性則需要觀察1周;霉菌生長也比較快，一般2-4天就可以發(fā)報告。

　　3.菌種鑒定

　　(1)絲狀真菌：包括皮膚癬菌和霉菌，根據(jù)菌落形成所需要的時間，在不同條件下生長的情況，菌落表面及背面的形態(tài)、色素，培養(yǎng)基中有無色素，培養(yǎng)物用乳酚棉藍(lán)染色后鏡檢找特征性標(biāo)志結(jié)構(gòu)。(2)酵母菌：分為形態(tài)學(xué)鑒定及生化試驗。形態(tài)學(xué)鑒定主要觀察有無假菌絲產(chǎn)生，如有則為念珠菌屬，如無則為念珠菌以外的酵母菌;生化試驗最為常用的是API系統(tǒng)，用此法鑒定準(zhǔn)確，但價格較貴。

　　)絲狀真菌：主要是形態(tài)學(xué)的鑒定，如直接涂片觀察，小培養(yǎng)顯微鏡鑒定，誘導(dǎo)形態(tài)觀察(25℃與35℃下雙相型真菌的特征孢子及菌絲的.產(chǎn)生和兩種菌落的形成及腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基，KT培養(yǎng)基，KelleyAgar培養(yǎng)基轉(zhuǎn)相誘導(dǎo)，另外常用的還有皮膚癬菌VB1生長刺激，吳氏熒光檢查，毛發(fā)穿孔試驗及在特殊情況下進(jìn)行的一些生化鑒定等。其中，小培養(yǎng)顯微鏡檢對于絲狀真菌的鑒定，特點是動態(tài)直觀，易于觀察，且節(jié)約材料。解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院皮膚科馬天

　　(2)酵母菌鑒定：形態(tài)學(xué)鑒定主要是玉米吐溫誘導(dǎo)下特征菌絲及特征孢子的檢驗，血清芽管形成，而在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上還必須進(jìn)行生化鑒定：有標(biāo)準(zhǔn)鑒定，自動儀器鑒定，顯色鑒定，其中，自動儀器鑒定(如API20C，ID32C等)，顯色鑒定對于酵母樣真菌的鑒定，特點是快速簡便;標(biāo)準(zhǔn)鑒定是按傳統(tǒng)雙歧表流程鑒定(包括糖同化試驗，糖發(fā)酵試驗，CAFC酚氧化酶試驗，尿酶試驗，KNO3同化試驗，脂肪酸需求試驗)，是真菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，系統(tǒng)準(zhǔn)確，缺點是程序繁瑣，耗時長，與臨床治療不太適應(yīng)。此外，還有血清學(xué)玻片凝集試驗，動物致病性實驗，分子生物學(xué)鑒定：如核酸雜交，DNA探針雜交，PCR擴(kuò)增序列分析，PCR-SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，PCR-RFLP限制性片段長度多態(tài)性分析，PCR-RAPD隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析，PFCG脈沖電泳核型分析等。

　　對于酵母樣真菌首選CHROMagar念珠菌顯色培養(yǎng)基，而顯色培養(yǎng)基不能鑒定的酵母樣真菌可采用自動儀器YBC卡進(jìn)行鑒定或API板;條件較差的實驗室可采用傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)鑒定法中鑒定值較高的試驗，如酚氧化酶鑒定新型隱球菌(+)，尿素區(qū)分毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(-)，念珠菌屬(-)(克柔念珠菌/溶脂念珠菌+)，球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(+)，玉米-土溫培養(yǎng)基上產(chǎn)菌絲區(qū)分念珠菌屬(+)與球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(-)與毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(+)。而同化試驗推薦平皿法，一個平皿內(nèi)可觀察多種糖類的同化情況，且結(jié)果易于觀察，重復(fù)性好。對于絲狀真菌及雙相型真菌，可采用小培養(yǎng)法，快速簡便易于觀察。而對于雙相型真菌還須經(jīng)過腦心浸液培養(yǎng)基轉(zhuǎn)相試驗后確證。而血清學(xué)及分子生物學(xué)則主要用于流行病學(xué)和一些難培養(yǎng)難鑒定真菌的檢驗，由于成本高或要求技術(shù)難度較高，故而不適合在常規(guī)工作中采

　　真菌的培養(yǎng)特性

　　真菌的營養(yǎng)要求不向。在一般細(xì)菌培養(yǎng)基上均能生長。檢查時常用沙保培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基成分簡單，主要含有1%蛋白陳、4%葡萄糖和2%瓊脂，pH佰55.皮膚癬拘在此培養(yǎng)基上生長較慢，常需1～4周;世腐生性真構(gòu)在此培養(yǎng)基上生長迅速。故分離真菌時常在此培養(yǎng)基戶加一定量的放線菌酮和氯霉素，前者用于抑制污染真菌，后者用于抑制細(xì)慚的生長。有些病原性真菌，如白假絲酵球菌、組織腦漿茵、新生隱球菌竿加放線菌酮即不能生良，故宜用力抗生京的血瓊脂平板，見有生長后移種沙保培養(yǎng)基，并問時做玻片培養(yǎng)以觀察其自然狀態(tài)下的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 培養(yǎng)真菌最適宜的酸堿度是PH值4.0～6.0，淺部感染真菌的最道溫度為22～28℃，但某些誅部感染真菌一般在37℃牛長最好。培養(yǎng)真菌需較尚的濕度與氧。

　　真菌的培養(yǎng)方法

　　玻片培養(yǎng)又稱小培養(yǎng)，小培養(yǎng)法可以隨時觀察真菌的生長形態(tài)(如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等)，還可以隨時觀察其生長發(fā)育的全部情況，有利于菌種的鑒定。

　　1、鋼環(huán)法

　　(1)材料：白假絲酵母菌、沙保弱培養(yǎng)基、無菌玻片、蓋玻片、鋼環(huán)(帶有缺 口)、石蠟。

　　(2)方法

　�、儆脽o菌鑷子取無菌小培養(yǎng)鋼環(huán)，環(huán)的兩面分別蘸取熔化的固體石蠟，平置于無菌載玻片上，另取一無菌蓋玻片，在酒精燈火焰上加熱后覆蓋于鋼環(huán)上，待冷后，小培養(yǎng)鋼圈即被固定于載玻片與蓋玻片之間。

　�、谟妹�細(xì)滴管吸取融化的培養(yǎng)基，從鋼環(huán)上端孔注入，注入量占容積的1/2即可。

　　③培養(yǎng)基冷卻凝固后，用接種針挑取材料，由上端孔接種于環(huán)內(nèi)培養(yǎng)基上。

　�、苤脻窈袃�(nèi)，室溫或37℃下培養(yǎng)2—3d后，逐日觀察，鏡下可連續(xù)看到真菌生長過程及菌絲、孢子等特征，一般7d左右即可長好。

　�、菀部刹挥眯∨囵B(yǎng)鋼環(huán)，直接將融化的培養(yǎng)基滴于無菌玻片上，待冷凝后從周邊接種材料，用蓋玻片覆蓋后培養(yǎng)，在顯微鏡下連續(xù)觀察生長情況。

　　(3)結(jié)果：鏡下觀察可見到有胞壁增厚的厚膜孢子及假菌絲。

　　2、小塊瓊脂玻片培養(yǎng)法

　　用無菌操作法將制好的待用瓊脂平板用無菌接種針或接種環(huán)切成大約1cm2的方塊，將其放置于滅菌的載玻片上。將標(biāo)本或待檢菌接種于瓊脂塊四周邊緣靠上方部位，然后用無菌鑷子取一無菌的蓋玻片蓋在瓊脂上。在無菌平皿內(nèi)放入少量無菌水和一個無菌U形(或V形)玻璃棒。將此載玻片置于玻璃棒上，蓋上平皿蓋培養(yǎng)。每日用肉眼和顯微鏡觀察孢子和菌絲的特點。