蛋白對非洲爪蛙早期胚胎發(fā)育中的作用

　　結(jié)蛋白除在細(xì)胞內(nèi)起到機(jī)械性的支撐作用外,還與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、心肌細(xì)胞收縮、再生、線粒體功能調(diào)節(jié)等功能有關(guān)，下面是小編搜集的一篇相關(guān)論文范文，歡迎閱讀查看。

　　前言

　　結(jié)蛋白(desmin)基因位于人類染色體2q35[1],編碼的結(jié)蛋白分子量為52000.結(jié)蛋白作為一種細(xì)胞骨架蛋白，是Ⅲ型中間纖維的重要成員之一[2-3],主要存在于肌細(xì)胞中,如平滑肌、骨骼肌、心肌[4-6]以及神經(jīng)肌肉接頭處，如突觸后膜、肌腱接點(diǎn)和肌纖維膜附著點(diǎn)[7-8].

　　結(jié)蛋白除在細(xì)胞內(nèi)起到機(jī)械性的支撐作用外,還與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、心肌細(xì)胞收縮、再生、線粒體功能調(diào)節(jié)等功能有關(guān)[9-10].結(jié)蛋白參與多種心臟相關(guān)疾病,例如結(jié)蛋白基因突變可以導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病、結(jié)蛋白相關(guān)心肌病等[11-13];過表達(dá)突變型的結(jié)蛋白可造成肌漿膜內(nèi)異常結(jié)蛋白積聚、排列紊亂，使心肌肥厚、功能受損，導(dǎo)致充血性心力衰竭;結(jié)蛋白表達(dá)異常出現(xiàn)于不同原因?qū)е碌男牧λソ哌^程中[14-15].

　　在利用基因敲除小鼠進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)蛋白基因敲除小鼠在胚胎發(fā)育期沒有明顯異常表型,但是小鼠出生后發(fā)生骨骼肌、心肌和平滑肌功能障礙[10],組織學(xué)分析顯示肌結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞和退化,平滑肌發(fā)育不全和退化,心肌細(xì)胞進(jìn)行性退化和壞死[16].其他研究也證實(shí),結(jié)蛋白是骨骼肌和心肌發(fā)育過程中重要的標(biāo)志和功能蛋白[11,17].

　　但是,結(jié)蛋白是否僅在出生后影響肌肉組織的發(fā)育,在胚胎早期發(fā)育中是否也發(fā)揮作用，目前尚未闡明。本文利用非洲爪蛙作為模式動物,研究結(jié)蛋白對早期胚胎發(fā)育中的作用.

　　1、材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1主要試劑人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgo-nadotropin,hCG,Sigma公司,美國)，DNaseⅠ、限制性核酸內(nèi)切酶、T7聚合酶、T4連接酶和RevertAidTMfirststrandcDNAsynthesiskit(ThermoFermentas公司,美國)，RNA純化試劑盒RNeasyMiniKit(QIA-GEN公司，德國)，Dig-UTP、anti-Dig-AP、BMPurple(Roche公司,瑞士)，RNA合成試劑SP6mMessageTMKit(Ambion公司，美國)，TaqDNA聚合酶、PrimeS-TAR@HSDNA聚合酶、SYBR@PremixExTaqTM定量PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)。

　　1.1.2引物和反義嗎啉代寡核苷酸結(jié)蛋白克隆引物序列為:上游引物:5′-CCGGGAATTCCAACCATGAGCCAGTCCTAC-3′;下游引物：5′-AATTGGTCCGCTTCCTGTGTAG-3′，定量PCR引物為：上游引物：5′-GGCACGTGTGGAGGTA-GAAA-3′，下游引物：5′-GCGTCTCTCCAGGTCTAT-GC-3′，其他定量PCR引物參見文獻(xiàn)[18].

　　根據(jù)結(jié)蛋白基因5′端序列設(shè)計特異性封閉結(jié)蛋白的反義嗎啉代寡核苷酸(morpholinooligonu-cleotide,MO)，命名為desminMO,序列為:5′-GGTTGCTTGAATAGGATGGCTCAT-3′，由美國GeneTools公司合成。

　　1.2方法

　　1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)結(jié)蛋白基因序列(GenBankAccessionNo:BC077922.1)設(shè)計克隆PCR引物,通過RT-PCR對結(jié)蛋白的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,雙酶切PCR產(chǎn)物并將其連接至pCS2+質(zhì)粒上，命名為pCS2+-desmin.

　　1.2.2胚胎操作及顯微注射試驗(yàn)前12h左右注射300~600UhCG誘導(dǎo)雌性爪蛙排卵。體外受精30min后，去除受精卵外的膠質(zhì)膜,在0.1×MBSH[1×MBSH:88mmol/LNaCl、2.4mmol/LNa2CO3、1mmol/LKCl、0.82mmol/LMgSO4、0.41mmol/LCaCl2、0.33mmol/LCa(NO3)2,10mmol/LHEPES,pH7.4]中培養(yǎng)至相應(yīng)發(fā)育階段。胚胎發(fā)育階段的劃分依照Nieuwkoop和Faber分期[19].將50ngdesminMO在胚胎4細(xì)胞期時注射入4個細(xì)胞中,以實(shí)現(xiàn)對結(jié)蛋白的敲降,將胚胎置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),用于表型觀察及基因表達(dá)分析.

　　1.2.3逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時定量PCR收集胚胎并提取RNA,以DNaseⅠ消化并用RNeasyMinikit純化.取1μg各胚胎總RNA用RevertAidTMfirststrandcDNAsynthesiskit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用TaKaRa的`SYBRGreen試劑盒進(jìn)行實(shí)時定量PCR.

　　1.2.4整胚原位雜交將pCS2+-desmin用EcoRⅠ，pCS2+-xbra用SalⅠ，pCS2+-Sox17α用ClaⅠ，pCS2+-Sox2用EcoRⅠ單酶切,隨后使用T7RNA聚合酶制備反義探針，反應(yīng)體系中加入Dig-UTP作為探針標(biāo)記。

　　收集并固定爪蛙胚胎,用梯度濃度乙醇進(jìn)行再水化,用蛋白酶K處理后進(jìn)行預(yù)雜交和雜交，加入anti-DIG-AP抗體后，與底物液BMpurple進(jìn)行顯色反應(yīng).

　　1.2.5Westernblot收集目標(biāo)胚胎，利用全蛋白試劑盒(南京凱基)提取蛋白,經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，依次孵育一抗和二抗，最后利用發(fā)光液顯色.β-actin(鼠源)抗體由美國SantaCruz公司生產(chǎn),結(jié)蛋白(兔源)抗體購自美國abcam公司,抗體稀釋比例均為1∶1000.

　　1.3統(tǒng)計學(xué)方法

　　定量RT-PCR所得數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±sx)表示，利用SPSS軟件進(jìn)行重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2、結(jié)果

　　2.1結(jié)蛋白在不同物種間的序列比對

　　針對人、小鼠、大鼠、雞以及熱帶爪蛙結(jié)蛋白的蛋白序列，采用clustal×2進(jìn)行氨基酸序列對比。結(jié)果顯示，結(jié)蛋白在6個不同物種間存在高度同源性，非洲爪蛙結(jié)蛋白氨基酸序列與人類以及小鼠的相似性為79%,與雞和大鼠的相似性為80%,與熱帶爪蛙的相似性為97%.在結(jié)蛋白3個主要功能區(qū)域中[3],rod區(qū)與C末端tail區(qū)在6個物種間具有高度的相似性,只是head區(qū)物種之間的差異較大，但各物種結(jié)蛋白在此區(qū)域都有1個保守區(qū)段，由7個芳香族氨基酸殘基和氨基末端保守的九肽(‘SSYRRTFGG’)組成(圖1)。

　　2.2結(jié)蛋白在非洲爪蛙胚胎發(fā)育不同時期的表達(dá)

　　為研究結(jié)蛋白在非洲爪蛙胚胎發(fā)育過程中不同時期的表達(dá),收取受精卵期(st.1)、卵裂期(st.4)、囊胚期(st.7)、原腸胚期(st.11)、神經(jīng)胚期(st.13、st.18)、尾芽期(st.28、st.32)、蝌蚪期(st.42)的胚胎，提取了不同時期胚胎的總RNA進(jìn)行實(shí)時定量RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，結(jié)蛋白的微弱表達(dá)起始于囊胚期，在神經(jīng)胚早期(st.13)出現(xiàn)明顯表達(dá),隨后在神經(jīng)胚期、尾芽期以及蝌蚪期持續(xù)高表達(dá)(圖2A)。

　　隨后利用原位雜交技術(shù)對結(jié)蛋白在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)部位進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,在st.11時結(jié)蛋白表達(dá)于外胚層以及中胚層區(qū)域，內(nèi)胚層未檢測到其表達(dá);st.18時表達(dá)于主干區(qū)域、肌、軸旁中胚層以及肌節(jié);st.32主要表達(dá)于肌節(jié)和心臟等肌肉組織,在神經(jīng)脊、后腦等神經(jīng)組織中也有表達(dá)(圖2B)。

　　2.3敲降結(jié)蛋白影響胚胎早期發(fā)育

　　通過敲降實(shí)驗(yàn)來研究結(jié)蛋白在早期發(fā)育中的作用時，首先利用Westernblot驗(yàn)證desminMO的敲降效率。結(jié)果顯示，與對照胚胎相比，注射desminMO的胚胎中結(jié)蛋白的表達(dá)量顯著減少(圖3A)。

　　胚胎發(fā)育過程中,在st.12時對照胚胎形成胚孔,而注射desminMO的胚胎發(fā)育遲緩，其胚孔尚未形成.

　　當(dāng)發(fā)育至st.32,與正常胚胎相比，敲降胚胎前后體軸明顯縮短,頭部以及眼也明顯變小(圖3B、C)。

　　2.4敲降結(jié)蛋白影響胚層分化

　　為研究結(jié)蛋白敲降后對胚層分化的影響,利用原位雜交技術(shù)檢測內(nèi)、中、外胚層標(biāo)志基因的表達(dá).結(jié)果顯示,注射desminMO的胚胎，其內(nèi)胚層標(biāo)志基因Sox17α，外胚層標(biāo)志基因Sox2的表達(dá)量都明顯下降,然而泛中胚層基因Xbra的表達(dá)量無明顯變化(圖4A)。利用實(shí)時定量RT-PCR檢測其他標(biāo)志性基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)中胚層基因FGF3、FGF8、NKX2-5、BMP4a、BMP4b、Chordin、DKK1、Wnt8,內(nèi)胚層標(biāo)志基因Mixer、Sox17α、GATA4、GATA6,以及外胚層標(biāo)志基因Sox2、Sox3、Geminin均受到不同程度的抑制(圖4B)。

　　3、討論

　　細(xì)胞骨架包括微絲、微管和中等纖維，在細(xì)胞中具有多種重要的生物學(xué)功能.

　　結(jié)蛋白是肌細(xì)胞中主要的中等纖維,在維持細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和胞外基質(zhì)聯(lián)結(jié)中起重要的作用.文獻(xiàn)報道,結(jié)蛋白基因敲除小鼠在胚胎發(fā)育期沒有明顯異常表型，僅在生后發(fā)生肌肉功能障礙。但是，出生后小鼠肌結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞和退化，平滑肌發(fā)育不全和退化，心肌細(xì)胞進(jìn)行性退化和壞死[16],結(jié)合其他文獻(xiàn)報道表明結(jié)蛋白在肌肉發(fā)育中發(fā)揮重要作用[10,20].但是結(jié)蛋白是否在胚胎發(fā)育早期發(fā)揮作用尚未闡明.本文利用非洲爪蛙作為模式動物，研究了結(jié)蛋白在胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式及其對早期胚層分化的影響。

　　首先，通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)在不同物種間結(jié)蛋白的氨基酸序列是高度保守的,提示結(jié)蛋白功能的保守性.進(jìn)而對結(jié)蛋白的表達(dá)模式進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。因?yàn)橐酝鶎?shí)驗(yàn)條件的限制，已有的關(guān)于結(jié)蛋白在細(xì)胞分化過程中表達(dá)的報道，無論是在體內(nèi)還是在體外培養(yǎng)條件下的觀察,都是從較晚的時期開始，如7d以上的雞胚，8.25d以上的鼠胚，或是十幾天以上的雞、鼠胚胎的肌肉所做的原代培養(yǎng)細(xì)胞[21-24],非洲爪蛙結(jié)蛋白的表達(dá)開始于st.14,高表達(dá)于st.28[25].

　　本研究利用原位雜交技術(shù)檢測其表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)原腸胚期之前的結(jié)果與以往報道類似，幾乎觀察不到陽性染色,但是從st.18期已觀察到明顯表達(dá)。進(jìn)而利用較為靈敏的實(shí)時定量PCR檢測出結(jié)蛋白在st.7已有微弱的表達(dá),在神經(jīng)胚早期即開始有明顯表達(dá).

　　這提示結(jié)蛋白可能在胚胎發(fā)育早期階段發(fā)揮作用.

　　在獲得了結(jié)蛋白表達(dá)于胚胎發(fā)育早期的結(jié)果后,利用敲降方法進(jìn)一步研究其功能,發(fā)現(xiàn)結(jié)蛋白敲降導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩,同時各胚層標(biāo)志基因均受到不同程度的抑制,胚層分化受到影響.

　　研究報道,結(jié)蛋白缺陷引起心肌相關(guān)疾病[12],而心肌細(xì)胞起源于中胚層,同時也受到內(nèi)胚層信號的影響[26].進(jìn)一步檢測中胚層、內(nèi)胚層中心臟發(fā)育相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn),中胚層基因FGF3、FGF8、NKX2-5、BMP4a、BMP4b,內(nèi)胚層基因GATA4、GATA6也隨著結(jié)蛋白的敲降而受到了抑制,而這些基因在早期參與或影響了心臟的發(fā)育.

　　以上心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)受抑的結(jié)果提示,雖然結(jié)蛋白缺失小鼠在胚胎期沒有明顯表型,僅在出生后出現(xiàn)心肌的發(fā)育異常,但結(jié)蛋白可能在胚胎發(fā)育早期階段即開始發(fā)揮作用,最終導(dǎo)致了出生后的發(fā)育缺陷,但是對于這一結(jié)論還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證.

　　結(jié)語

　　綜上所述,在非洲爪蛙胚胎發(fā)育過程中,結(jié)蛋白的低水平表達(dá)起始于囊胚期,敲降結(jié)蛋白阻礙了胚層分化,抑制心臟發(fā)育相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá).